引导编辑系统（Prime Editor, PE）是能够在基因组的靶位点处实现任意碱基替换和小片段精准删除、插入的新型基因组编辑工具，是基因组编辑领域的重大变革。2020年，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞团队通过探索融合不同的逆转录酶、工作温度、pegRNA表达形式、PBS和RT模板序列长度等条件，率先在水稻和小麦中成功建立并优化了适用于植物的引导编辑器（Plant Prime Editor, PPE）（Lin et al., Nature Biotechnology, 2020）。随后，团队建立了基于熔解温度值（Tm）指导的PBS序列设计方案，提出了dual-pegRNA策略，并进一步开发了植物pegRNA设计网站——PlantPegDesigner，极大提高了引导编辑效率并简化了植物pegRNA的设计流程（Lin et al., Nature Biotechnology, 2021）。此外，该团队还通过全基因组重测序发现PPE系统在全基因组水平上具有很高的特异性（Jin et al., Nature Biotechnology, 2021）。这些研究为引导编辑系统在植物领域的应用奠定了良好的基础。尽管如此，引导编辑系统目前在植物中的编辑效率仍不够高，且有很大的靶点依赖性，这些短板严重限制了引导编辑在植物中的广泛应用。因此，如何优化引导编辑系统突破现有的限制，提升引导编辑技术的高效性、广适性仍然是领域内的研究重点。
近日，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组与合作者发表研究成果，在植物中成功建立了更高效、广适的新型引导编辑系统ePPE（Engineered Plant Prime Editor）。不同于大多数已报道的通过优化pegRNA提高引导编辑效率的思路，该研究侧重于对引导编辑系统的蛋白组分进行改造。通过筛选包含不同逆转录酶M-MLV RT变体以及融合不同病毒相关蛋白的候选PPE系统，研究人员发现删除M-MLV RT的RNase H结构域或在M-MLV RT 的N端融合病毒核衣壳蛋白（Nucleocapsid，NC），可以分别将PPE的编辑效率提高2.0倍和3.2倍。研究人员推测，RNase H结构域的去除稳定了sgRNA-DNA和nCas9-RT-pegRNA复合体中的RNA-DNA异源双链结构，NC蛋白通过其核酸退火活性在逆转录过程中辅助MLV-RT发挥功能。进一步地，研究人员通过整合以上两种优化策略，开发出了升级版新型引导编辑器ePPE。相比于PPE，ePPE在碱基替换、小片段插入、删除以及较大片段的插入和删除等多种编辑类型下编辑效率平均可提高5.8倍，且不增加脱靶及副产物的发生。此外，当将新型引导编辑器ePPE与该课题组先前报道的dual-pegRNA策略（Lin et al., Nature Biotechnology, 2021）和David Liu 实验室研发的epegRNA（Engineered pegRNA）策略（Nelson et al., Nature Biotechnology, 2021）相结合时，可以进一步提高引导编辑系统在内源基因上进行精准编辑的效率。最后，研究人员利用ePPE系统成功创制了可抗甲咪唑烟酸和烟嘧磺隆两种除草剂的水稻新材料。
综上所述，研究人员通过聚焦改造PPE的蛋白组分，成功开发了能够在植物中实现高效编辑的新型引导编辑系统ePPE，并证明ePPE与现有的pegRNA优化策略相结合可进一步提升编辑效率，这一系统的开发将有望推动引导编辑在农业育种、作物改良等方面的应用。相关研究成果于2022年3月24日在线发表在Nature Biotechnology杂志（DOI:10.1038/s41587-022-01254-w）。中科院遗传发育所曹晓风研究组、上海科技大学黄行许研究组共同参与了该研究。高彩霞研究组博士后宗媛、博士生刘怡静和薛郴销为本文的共同第一作者；高彩霞研究员与曹晓风研究员为本文共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金和中国科学院战略性先导专项A的资助。
图：植物高效新型引导编辑器ePPE的建立及应用。
a-b，原生质体报告系统筛选候选植物引导编辑系统。
c，基于删除RNase H结构域和融合NC蛋白两种策略构建的引导编辑器与PPE编辑效率对比。
d, ePPE示意图。e，四种不同引导编辑器编辑效率对比。
f，ePPE与已报道pegRNA优化策略结合的编辑效率对比。
g，ALS-W548M水稻突变体在不同除草剂处理下的表型。
